La restricción conformacional da forma a la inhibición de una proteína adaptadora de eflujo de múltiples fármacos

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 3900 (2023) Citar este artículo

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Las bombas de eflujo de membrana desempeñan un papel importante en la resistencia bacteriana a múltiples fármacos. El sistema tripartito de bomba de eflujo de múltiples fármacos de Escherichia coli, AcrAB-TolC, es un objetivo de inhibición para disminuir el desarrollo de resistencia y restaurar la eficacia de los antibióticos, con homólogos en otros patógenos de ESKAPE. Aquí, racionalizamos un mecanismo de inhibición contra la proteína adaptadora periplásmica, AcrA, utilizando una combinación de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio, ensayos de eflujo celular y simulaciones de dinámica molecular. Definimos la dinámica estructural de AcrA y encontramos que un inhibidor puede infligir una estabilización de largo alcance en sus cuatro dominios, mientras que un sustrato de eflujo que interactúa tiene un efecto mínimo. Nuestros resultados respaldan un modelo en el que un inhibidor forma una cuña molecular dentro de una hendidura entre los dominios lipoilo y barril αβ de AcrA, disminuyendo su transmisión conformacional de señales evocadas por fármacos de AcrB a TolC. Este trabajo proporciona información molecular sobre la función de la proteína adaptadora de múltiples fármacos que podría ser valiosa para desarrollar terapias antimicrobianas.

La resistencia a múltiples fármacos se refiere a la capacidad de las bacterias patógenas para sobrevivir a dosis letales de muchos compuestos estructuralmente diversos1. La resistencia bacteriana a múltiples medicamentos continúa propagándose a un ritmo alarmante, amenazando la salud humana en todo el mundo. En 2019, la resistencia bacteriana a múltiples medicamentos causó directamente 1,27 millones de muertes en todo el mundo, más que el VIH y la malaria combinados2.

Un mecanismo importante de resistencia a múltiples fármacos es la actividad de las bombas de eflujo3,4. Las bombas de eflujo suelen sobreexpresarse en respuesta a la exposición a antibióticos y pueden exportar una amplia gama de compuestos químicamente diversos, lo que reduce la concentración intracelular de antibióticos y confiere resistencia a los medicamentos1. La familia de transportadores de división celular y nodulación de resistencia hidrófoba y anfifílica (HAE-RND) desempeña un papel clave en la resistencia bacteriana a múltiples fármacos. Escherichia coli AcrAB-TolC es el miembro prototípico de esta familia con homólogos en otras bacterias ESKAPE gramnegativas5,6,7. Es un complejo proteico tripartito que abarca la envoltura de la membrana de las bacterias gramnegativas, donde AcrB es el transportador de membrana interna del complejo, AcrA la proteína adaptadora periplásmica (PAP) de la familia de proteínas de la proteína de fusión de membrana (MFP) y TolC. el canal de la membrana exterior (Fig. 1a). Energizado por la fuerza motriz del protón, AcrB transporta sustratos, incluidos antibióticos, desde el entorno intracelular al exterior de la célula, a través de un canal sellado formado por AcrA y TolC (Fig. 1a)8,9.

a Esquema del complejo AcrAB-TolC incrustado en la envoltura celular. Lipopolisacárido LPS. b Estructura de AcrA aislada del complejo AcrAB-TolC completo (PDB:5O66)23. c Tres construcciones de AcrA. AcrAL contiene Cys25 que se lipida después de la escisión del péptido señal 1-24. AcrAS contiene una mutación Cys25Met y, por lo tanto, carece de lipidación y péptido señal. AcrASD contiene dos secuencias AcrAS conectadas por un enlazador TRRIT. d Caracterización de MS nativa de las construcciones de AcrA a pH 6,0. El tampón de proteínas se intercambió en tampón de acetato de amonio 100 mM antes de la EM. AcrAL requirió la presencia de 2 × concentración micelar crítica (CMC) de DDM al 0,03%. AcrAL se presenta como una mezcla de monómeros y dímeros, AcrAS como monómeros y AcrASD como dímero. Los espectros recopilados en réplicas biológicas y mediante dos sistemas de MS nativos diferentes, un sistema de tiempo de vuelo y un sistema orbittrap, brindan confianza en que estas firmas espectrales no son artefactos de la preparación de proteínas o la detección de MS67. Los sobres marcados con un asterisco (*) representan el estado de carga más alto indicativo de desorden intrínseco. Masas encontradas en la Tabla complementaria 1.

Se han realizado esfuerzos para desarrollar inhibidores de la bomba de eflujo (EPI) contra estos sistemas para "reavivar" las actividades de varios antibióticos preexistentes, a los que una población bacteriana se ha vuelto resistente10. Hasta ahora, el objetivo ha sido generar EPI dirigidos al propio transportador AcrB. Sin embargo, los EPI identificados previamente no han logrado progresar a ensayos clínicos debido a problemas de toxicidad y la naturaleza promiscua de AcrB para transportar sus inhibidores11,12. Por lo tanto, existe la necesidad de explorar otras vías en la búsqueda de generar EPI exitosas, con AcrA emergiendo como un objetivo potencial para la inhibición10,13. Recientemente, NSC 60339 fue identificado como un inhibidor de AcrA a través de una evaluación computacional experimental conjunta10. Trabajos anteriores sugirieron que NSC 60339 podría causar un cambio conformacional en AcrA y propusieron un posible sitio de unión en la interfaz entre los dominios lipoilo y barril αβ, denominado sitio IV (Fig. 1b) 10,14. Además, recientemente se ha demostrado que AcrA tiene funciones más diversas, identificándose como una "necroseñal" bacteriana dentro de los enjambres de E. coli15: cuando una subpoblación del enjambre muere, las células muertas liberan la necroseñal AcrA, que se une a TolC en el exterior de otras bacterias. células vivas, estimulando el flujo de salida dentro del área afectada y la regulación positiva de varias bombas de flujo de salida16. Curiosamente, un trabajo reciente también ha demostrado que NSC 60339 puede inhibir la capacidad de necroseñalización mediada por AcrA16. Por lo tanto, comprender los mecanismos moleculares de la inhibición de AcrA es importante para el futuro descubrimiento de fármacos de necroseñalización y EPI. Sin embargo, sigue siendo difícil encontrar un mecanismo de inhibición de AcrA.

AcrA actúa como una proteína adaptadora flexible entre AcrB y TolC, siendo su forma alargada esencial para esta función17,18,19. Se ha propuesto formar un trímero de dímeros en el complejo ensamblado para mantener un canal sellado y acomodar el movimiento conformacional de AcrB a medida que recorre su mecanismo de eflujo rotacional20. Después de la escisión del péptido señal, AcrA se lipida en Cys25, lo que lo ancla a la membrana interna, aunque estudios previos han demostrado que la presencia del resto lipídico no es necesaria para la función de AcrA17,18,21,22. AcrA consta de cuatro dominios dispuestos linealmente, los dominios de horquilla α-helicoidal, lipoilo, barril αβ y membrana proximal (MP), cada uno de ellos conectado por pequeños conectores flexibles (Fig. 1b). El barril αβ y los dominios MP interactúan con AcrB, mientras que el dominio helicoidal α interactúa con las bobinas helicoidales α periplásmicas de TolC, donde se propone regular sus estados "abierto" y "cerrado"23.

Aquí, utilizamos una combinación de espectrometría de masas de intercambio nativo y de hidrógeno/deuterio (nMS y HDX-MS), simulaciones de dinámica molecular (MD), ensayos de eflujo biofísico y celular para determinar un mecanismo de acción para el inhibidor de AcrA, NSC 6033910,14. . Nuestros resultados sugieren que NSC 60339 actúa como una cuña molecular dentro de una hendidura entre los dominios lipoilo y barril αβ de AcrA, reduciendo su dinámica estructural en los cuatro dominios. Además, investigamos un sustrato de eflujo, la novobiocina, que se sabe que se une a AcrA, pero no inhibe el eflujo, lo que revela un cambio mínimo en la dinámica de AcrA en presencia de novobiocina. También realizamos ensayos de eflujo in vivo con mutantes de AcrA, para investigar si apuntar deliberadamente a AcrA al barril de lipoil-αβ y a los conectores flexibles de barril-MP de αβ podría afectar el eflujo. Esto confirmó la hendidura de lipoil-αβ como un sitio farmacológico para atacar AcrA durante el flujo de salida y reveló un posible sitio entre los dominios MP-barril de αβ para el diseño futuro de fármacos. En general, nuestros resultados sugieren que NSC 60339 inhibe el eflujo mediante la restricción de la dinámica estructural de AcrA, lo que podría reducir la eficiencia de la rotación funcional de AcrAB-TolC y posiblemente perturbar las interacciones dentro del propio complejo durante el eflujo y la necroseñalización.

Para imitar mejor el entorno periplásmico de AcrA (el citosol tiene un promedio de 1,7 unidades de pH más alto que el entorno externo), realizamos nuestras investigaciones a un pH de 6,024,25,26. Esto también garantizará que nuestros hallazgos sean consistentes con trabajos microbiológicos y bioquímicos previos realizados en NSC 60339, que se completó a pH 6.010,14,27. En consecuencia, nuestros tiempos de etiquetado HDX se modificaron para representar con precisión los tiempos de etiquetado típicos a pH fisiológico (ver Métodos), ya que el pH influye en los tipos de cambio de HDX.

Para comprender la dinámica estructural de AcrA, optimizamos nuestra muestra para su investigación mediante HDX-MS, que proporciona información a nivel molecular sobre la conformación y dinámica de las proteínas28. HDX ocurre cuando los hidrógenos de amida en la cadena principal del péptido se vuelven accesibles al tampón deuterado y experimentan un intercambio isotópico con D2O. La accesibilidad resulta del despliegue estructural y la rotura de los enlaces de hidrógeno, por lo que las regiones no estructuradas exhiben un intercambio rápido cuando se exponen al solvente, mientras que las regiones con estructuras secundarias estables exhiben un intercambio más lento ya que estas regiones están protegidas y estabilizadas por redes de enlaces de hidrógeno. Para permitir una interpretación confiable del efecto de las interacciones del inhibidor y el sustrato en la dinámica de AcrA, exploramos construcciones que garantizarían la homogeneidad de la muestra (Fig. 1c). Monitorizamos la homogeneidad oligomérica mediante nMS, que permite que las proteínas intactas se transfieran a la fase gaseosa preservando al mismo tiempo las interacciones no covalentes y, por lo tanto, es experto en informar sobre los estados oligoméricos de las proteínas29,30.

Primero purificamos AcrA que contiene su péptido señal (residuos 1 a 24), que se escinde después de la lipidación en Cys25 (AcrAL) (Fig. 1c) 27. Esta construcción está asociada con la membrana y, por lo tanto, se purificó a partir de la membrana en micelas de detergente de n-dodecil-β-d-maltopiranósido (DDM). La nMS reveló que AcrAL existía como una mezcla de monómeros y dímeros a pH 6,0 (Fig. 1d); a pH 7,4, AcrAL tenía una mayor heterogeneidad, formando monómeros y hasta pentámeros (Figura complementaria 1). Este grado de heterogeneidad complicaría la interpretación de HDX-MS, por lo tanto, consideramos que AcrA carece de lipidación (AcrAS), que previamente se ha demostrado que conserva su funcionalidad y se ha utilizado en varios otros estudios16,17,18,27. AcrAS carece de su péptido señal (residuos 1 a 24) y su Cys25 se reemplaza por una metionina inicial (Met25). Se expresa y purifica a partir del citosol y carece de lipidación en su extremo N. Los estudios de nMS de AcrAS revelaron que era completamente monomérico tanto a pH 7,4 como a 6,0 (Fig. 1d y Fig. 1 complementaria). Por lo tanto, decidimos proceder con la construcción AcrAS para nuestras investigaciones a pH 6,0.

Como AcrA forma un trímero de dímeros en el complejo ensamblado, también exploramos una construcción de pseudodímero de AcrA (AcrASD) (Fig. 1c). Esto nos permitirá probar el efecto de la dimerización en la dinámica estructural de AcrA y cómo la inhibición de NSC 60339 se ve afectada por la presencia de una interfaz dímera. La construcción contenía dos secuencias de AcrAS conectadas por un conector de cinco aminoácidos, y la nMS confirma que es un pseudodímero homogéneo a pH 6,0 (Fig. 1d).

Además de dilucidar la estequiometría, las distribuciones del estado de carga (CSD) observadas en los espectros nMS pueden informar sobre propiedades conformacionales31,32. Curiosamente, nuestros espectros nMS indican que AcrA podría contener áreas de desorden intrínseco en todas las construcciones. Los espectros nMS de las tres construcciones presentan al menos dos CSD, lo que refleja poblaciones de confórmeros plegados y más desestructurados que se producen durante la ionización de proteínas en la fase gaseosa (Fig. 1d y Fig. 1 complementaria). Se ha descubierto que las CSD mixtas como éstas son diagnósticas de proteínas plegadas que contienen áreas de desorden intrínseco33. Es probable que esta área sea el dominio MP como se postuló anteriormente, ya que a menudo no se resuelve en las estructuras cristalinas18,34.

A continuación, utilizamos HDX-MS para evaluar la dinámica intrínseca de nuestras construcciones AcrA. Después de la optimización de la extinción y la digestión en AcrAS (ver 'Métodos' y la Figura complementaria 2), pudimos lograr una cobertura de secuencia> 95% para nuestras investigaciones HDX-MS. Un análisis de absorción fraccional relativa de deuterio de AcrAS revela áreas con intercambio dependiente del tiempo, característico de una proteína plegada con diferencias en la estructura secundaria y la dinámica (Figura complementaria 3). Las hélices α muestran un fuerte nivel de protección durante todo el transcurso del tiempo HDX, lo que sugiere que esta es el área estructuralmente más estable de AcrA. Sin embargo, los péptidos dentro de áreas del MP (residuos 25–42, 375–380) y dominios de barril αβ (residuos 264-275) demostraron una incorporación de deuterio casi máxima incluso en los puntos de tiempo más tempranos (10 s), lo que es indicativo de deuterio no estructurado. regiones35. Esto respalda aún más que el dominio MP contiene predominantemente áreas de desorden intrínseco. Ampliando aún más esta noción, evaluamos la estructura de AcrA según lo predicho por AlphaFold2 (Figura complementaria 4) 36,37. AlphaFold2 proporciona una puntuación de confianza por residuo (pLDDT) entre 0 y 100 para cada residuo; las regiones con una puntuación < 50 pueden no estar estructuradas. Las regiones 1–36 y 379–397 están en el dominio MP y contienen muchos residuos con una puntuación de pLDDT <50. Esto está de acuerdo con nuestros resultados de espectrometría de masas de que el dominio MP contiene regiones no estructuradas. Por tanto, clasificamos a AcrA como una proteína plegada con áreas de desorden intrínseco. Esto probablemente beneficia a AcrA funcionalmente como PAP, ya que el periplasma es un entorno dinámico que puede cambiar de tamaño en diferentes condiciones, y se requiere que AcrA sea lo suficientemente flexible para adaptarse a estos cambios para mantener un canal sellado en el complejo ensamblado38.

Para explorar los efectos de la inhibición de NSC 60339 en AcrAS, realizamos HDX diferencial (ΔHDX) entre AcrAS + NSC 60339 y AcrAS solo. ΔHDX analiza la diferencia entre dos estados y es un enfoque sensible para caracterizar y localizar el efecto de una condición en la dinámica estructural de una proteína39. Para un péptido determinado, calculamos la cantidad de deuterio incorporado en cada estado proteico (sin fármaco/NSC 60339/novobiocina) comparando el centroide m/z para un momento dado con una muestra de referencia no deuterada. En la Fig. 2a, podemos ver que para un péptido representativo (residuos 308–323), después de 1 min la cantidad de deuterio incorporada es la misma para AcrAS sin fármaco y con novobiocina, pero en presencia de NSC 60339 hay > 1 Da reducción en la absorción de deuterio.

a El espectro m/z para el péptido 308-323 en condiciones no deuterantes y condiciones deuterantes con DMSO, NSC 60339 y novobiocina. El centroide está representado por la línea de puntos y el cambio de masa de las muestras deuteradas está escrito en Daltons. b Gráfico de Chiclet que muestra los gráficos diferenciales de HDX (ΔHDX) para AcrAS +/− NSC 60339 para todos los puntos de tiempo recopilados. El azul significa áreas con HDX disminuido entre estados. Definimos la significancia como ± ≥ 0,33 Da de cambio (ver 'Métodos' y Fig. complementaria 9) con un valor de P ≤ 0,01 en una prueba t de Welch bilateral (8 mediciones independientes: nbiológicas = 2 y ntécnicas = 4). Las áreas blancas representan regiones con ΔHDX insignificante. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. c ΔHDX para ((AcrAS + NSC 60339) – AcrAS) para el último punto temporal se pinta en la estructura AcrA (PDB:5O66) usando HDeXplosion y Chimera23,55,56. Se muestra el inserto ampliado del sitio IV, con las cadenas laterales de los residuos implicados resaltadas14. d Gráficos de absorción para tres péptidos en diferentes dominios de AcrA. Los gráficos de absorción son la absorción promedio de deuterio y las barras de error indican la desviación estándar (8 mediciones independientes: nbiológicas = 2 y ntécnicas = 4).

En presencia de NSC 60339, AcrAS exhibió estabilización en los cuatro dominios (Fig. 2b, c), con la región del sitio IV, identificada como un posible sitio de unión dentro de una hendidura entre los dominios lipoilo y barril αβ mediante modelado computacional y espectroscopia de fluorescencia Trp14 —ser afectado (Figs. 2c y 3a, b). Porciones del sitio IV mostraron una disminución significativa en la absorción de deuterio en presencia de NSC 60339 (Fig. 2b-d), y los péptidos, incluidos los residuos F81 y F254, mostraron una absorción disminuida. Los residuos F81 (dominio lipoilo) y F254 (dominio barril αβ) están implicados en la unión de NSC 60339 y F81 también es esencial para la función de eflujo. La reducción de HDX dentro de estas áreas puede deberse a la unión del fármaco que estabiliza el área local a través de interacciones directas con hidrógenos de amida, o a una reducción en la accesibilidad al solvente dentro de los dominios implicados. Basado en la estructura acoplada (Fig. 3a), el sitio IV del soporte F81 y F254, pero no hacen contacto directo con NSC 60339. Sin embargo, en las simulaciones MD, F254 muestra fluctuaciones reducidas (Fig. 3d) y tanto F81 como F254 muestran una reducción del disolvente. -área de superficie accesible (SASA; Figura complementaria 5), ​​que demuestra cómo la unión de NSC 60339 puede tener efectos alostéricos en diferentes regiones de AcrA. Nuestros datos de HDX-MS y MD, junto con el trabajo anterior, respaldan que el sitio IV es el sitio de unión de NSC 60339.

a Estructura acoplada de NSC 60339 (centro) a AcrA de Darzynkiewicz et al.14. F81 y F254 se muestran encima y debajo de NSC 60339, respectivamente. b Vista ampliada de la hendidura del bolsillo de encuadernación NSC 60339. AcrA se muestra en una representación de superficie. c Estructura NSC 60339; Los valores de pKa calculados para los grupos de dihidroimidazolina son > 9, lo que sugiere que es dicatiónico a pH 6,068. d AcrA coloreado de acuerdo con la diferencia en las fluctuaciones cuadráticas medias (RMSF) entre simulaciones de los estados unido y apo, promediadas en cuatro réplicas para cada una. El rojo indica que el RMSF es mayor en el estado ligado, mientras que el azul indica que es mayor en el estado apo (el rango de colores va desde −2 Å, azul, hasta 2 Å, rojo, como lo indica la barra de colores). RMSF se calculó durante los últimos 70 ns de cada simulación de 100 ns.

Aparte del sitio IV, nuestros resultados de HDX revelan que NSC 60339 induce una estabilización de largo alcance de la dinámica estructural de AcrA lejos del sitio de unión de NSC 60339. Las horquillas de hélice α muestran estabilización en ambas hélices y en el conector flexible, principalmente en los puntos temporales posteriores. Es probable que esto se deba a la estabilización exhibida por el dominio lipoílo debido a NSC 60339, lo que restringe la capacidad de AcrA para posicionar libremente las hélices, posiblemente reduciendo su plasticidad conformacional. Además, el dominio MP exhibe una amplia protección en presencia de NSC 60339. El mayor grado de protección en el dominio MP ocurre entre los residuos 308-324, con múltiples péptidos dentro de esta región que muestran una protección sostenida durante todo el transcurso del tiempo HDX (Fig. 2b,c). Nuestros hallazgos respaldan que los efectos observados en estos dominios son un efecto posterior de NSC 60339 en lugar de sitios de unión secundarios. Las fluctuaciones cuadráticas medias (RMSF) de nuestras simulaciones MD de los estados unido y apo muestran un alto grado de estabilización de los residuos 308–324 incluso en comparación con otros residuos (Fig. 3d y Fig. 6 complementaria), lo que respalda nuestros datos HDX y proporciona Confianza en que NSC 60339 puede causar una estabilización de la dinámica a largo plazo lejos del sitio de unión propuesto. También se ha demostrado que AcrA que carece del dominio MP todavía está unido a NSC 60339, lo que sugiere que su estabilización es alostérica para la unión de NSC 60339 al sitio IV14. En contraste con el dominio MP, la diferencia en RMSF para el dominio lipoilo fue modesta (Fig. 3d y Fig. 6 complementaria); sin embargo, partes del dominio lipoilo vieron SASA reducida, lo que posiblemente explica la mayor protección observada por HDX-MS (Figura complementaria 5). Curiosamente, algunas áreas de los dominios de barril MP, lipoilo y αβ experimentaron un aumento de SASA en las simulaciones de MD, pero mostraron una reducción de RMSF o HDX (Figura complementaria 5). Esta observación respalda que, incluso con una mayor accesibilidad a los solventes, la protección mejorada de la amida principal de HDX en estas regiones probablemente esté dominada por su dinámica estructural restringida.

Como control y comparación con NSC 60339, investigamos el efecto de la novobiocina en la dinámica de AcrAS. La novobiocina es un sustrato de AcrAB-TolC, se une a AcrA y aún no se clasifica como EPI10. Como antes, realizamos HDX diferencial con AcrAS + novobiocina y AcrAS solo (Fig. 2d y Fig. complementaria 7). Nuestros resultados muestran que la novobiocina tiene poco efecto observado en la dinámica estructural de AcrA dentro de nuestros experimentos HDX, lo que contrasta fuertemente con NSC 60339. Los gráficos de absorción de péptidos en la Fig. 2d muestran tres péptidos en tres dominios que exhiben una protección estadísticamente significativa cuando son inhibidos por NSC. 60339 (trama azul). El gráfico negro representa la absorción de un péptido en presencia de novobiocina y el gráfico verde representa AcrAS solo. Como muestran los gráficos de absorción, no hay diferencia en la incorporación de deuterio entre AcrAS solo y con novobiocina, aunque el porcentaje de complejo proteína:ligando fue el mismo (ver Métodos). Como experimento de apoyo, monitoreamos la unión de novobiocina a AcrAS usando nMS (Figura complementaria 8 y Tabla complementaria 2) y observamos el complejo proteína:ligando. En general, observamos que, si bien es un sustrato de AcrA, la novobiocina no tiene efectos globales sobre la dinámica estructural como NSC 60339 (Figura complementaria 9). Esto respalda nuestra premisa de que NSC 60339 es un inhibidor exitoso de AcrA debido a su capacidad para estabilizar AcrA en sus cuatro dominios. AcrA depende de su dinamismo y flexibilidad para funcionar como PAP19, por lo que restringir esta capacidad conformacional puede ser un objetivo prometedor para la inhibición en general.

Para caracterizar el efecto de la dimerización en la dinámica estructural de AcrA, realizamos HDX diferencial entre el monómero y el dímero (Figura complementaria 10). AcrASD experimentó áreas de HDX disminuido en comparación con AcrAS y, por lo tanto, una estabilización en los cuatro dominios. El área que mostró la mayor disminución en ΔHDX fueron las horquillas de hélice α en el último punto de tiempo (10 min). Esta protección podría explicarse por el empaquetamiento complementario de las horquillas de hélice α en el dímero que conduce a una estabilización de su estructura y una posible exclusión del disolvente en la interfaz de unión40. El dominio MP también mostró protección en los puntos temporales posteriores entre los residuos 306–342 y el barril αβ (residuos 261–288) en los puntos temporales iniciales (10–60 s), lo que sugiere que la dimerización también puede proporcionar más orden estructural a estas regiones.

Nuestra investigación HDX-MS muestra que AcrASD tiene una dinámica única en comparación con el monómero, aunque posee una estabilidad térmica similar a la construcción AcrAS, a juzgar por el dicroísmo circular (CD, figura complementaria 11). Esto puede ayudar en su asociación en un complejo con AcrB. Para probar esto, comparamos la unión de AcrAS y AcrASD a AcrB en nanodiscos SMALP (partículas lipídicas de ácido estireno maleico) utilizando SMA-PAGE, que es un método de PAGE nativo adaptado para su uso con SMALP (Figura complementaria 12)41,42 . Proporciona información estequiométrica y puede revelar la formación de complejos proteicos. AcrAS parece unirse a AcrB SMALP triméricos en un modelo 1:1, como se informó anteriormente, sin embargo, AcrASD parece unirse a AcrB trimérico en una variedad de estequiometrías diferentes, que no se resolvieron mediante análisis SMA-PAGE, lo que sugiere que la dimerización promueve la interacción AcrA de orden superior. (s) con AcrB trimérico incrustado en un entorno lipídico27.

Para caracterizar las interacciones de AcrASD con NSC 60339, utilizamos un ensayo de unión de resonancia de plasmón superficial (SPR). Para este propósito, se inmovilizaron AcrAS y AcrASD en un chip a densidades similares de 4743 y 4054 unidades de respuesta (RU), respectivamente, y se inyectaron concentraciones crecientes de NSC 60339 de 6 μM a 200 μM sobre las proteínas inmovilizadas. Esta fue una forma eficaz de confirmar cualitativamente una unión similar de NSC 60339 a las dos variantes de AcrA, lo que sugiere que la pseudodimerización no afecta el modo de interacción de NSC 60339 con el sitio de unión de AcrA (Figura complementaria 11).

Para investigar si la dimerización de AcrA tiene un efecto sobre la inhibición de NSC 60339, repetimos nuestros experimentos diferenciales de HDX con la construcción AcrASD (Fig. 1c). Nuestros resultados muestran que NSC 60339 actúa de manera similar cuando AcrA es un dímero (Fig. 4a). Existe una protección estadísticamente significativa en los cuatro dominios, como se observa con AcrAS, con una protección HDX pronunciada en todo el dominio lipoílo, donde se encuentra el sitio IV, lo que sugiere que el fármaco actúa en un área similar. Además, AcrASD exhibe una amplia protección en el dominio MP, y el núcleo de esta estabilización ocurre en la misma región (residuos 306–324). También hay una estabilización a través de la hélice α2 en la horquilla de hélice α; sin embargo, menos péptidos y una región más pequeña en comparación con AcrAS. Una posibilidad de que esto pueda deberse a que el empaquetamiento de las horquillas en el dímero ya hace que la región sea más estable en comparación con el monómero (Figura complementaria 10). Por lo tanto, las horquillas pueden verse menos afectadas por la inhibición de NSC 60339 en el dímero.

un gráfico de Chiclet que muestra los gráficos diferenciales de HDX (ΔHDX) para AcrASD +/− NSC 60339 para todos los puntos de tiempo recopilados. El azul significa áreas con HDX disminuido entre estados. Definimos significancia como un cambio de ± ≥ 0,35 Da (ver 'Métodos'), con un valor de P ≤ 0,01 en una prueba t de Welch bilateral (7 mediciones independientes: nbiológicas = 2 y ntécnicas = 3-4). Las áreas blancas representan regiones con ΔHDX insignificante. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. b ΔHDX para ((AcrASD + NSC 60339) – AcrASD) para el punto de tiempo de 10 minutos se pinta sobre la estructura AcrA (PDB:5O66) usando HDeXplosion y Chimera23,55,56. c AcrASD simulado coloreado según la diferencia en RMSF durante los últimos 70 ns de simulaciones de 100 ns de los estados unido y apo, promediados en cuatro réplicas para cada uno. El azul indica que el RMSF es mayor en el estado apo que en el estado unido, mientras que el blanco indica que son similares en ambos estados (el rango de color va desde −2 Å, azul, hasta 0 Å, blanco).

Curiosamente, vemos que hay una región reducida del dominio barril αβ que se está estabilizando, en el otro lado del sitio IV. Cuando AcrASD se inhibe con NSC 60339, solo los residuos 232–246 y 249–261 muestran una protección significativa, mientras que AcrAS muestra protección entre los residuos 228–260 y 52–62, lo que puede sugerir una diferencia en cómo interactúa el fármaco dentro del sitio de unión. .

En general, NSC 60339 parece estar inhibiendo AcrASD de manera similar, al reducir la dinámica estructural de AcrA en toda la proteína. Para respaldar esta hipótesis, también realizamos simulaciones de los estados ligado y apo de un AcrASD modelado a partir de una estructura cristalina existente (PDB 2F1M)18. Se observó una reducción notable en el RMSF para el estado unido en la mayoría de ambas copias de la proteína en comparación con el estado apo (Fig. 4c y Fig. 13 complementaria).

Como antes, también investigamos el efecto de la novobiocina en AcrASD. La novobiocina pareció tener poco efecto sobre la dinámica estructural de AcrASD, lo que coincide con lo que mostraron nuestros resultados para AcrAS (Figura 14 complementaria). Al igual que con AcrAS, pudimos capturar el complejo proteína:ligando durante nMS (Figura complementaria 8 y Tabla complementaria 2).

Para determinar si apuntar a las regiones bisagra flexibles de AcrA podría conducir a la inhibición del flujo de salida de antibióticos por AcrAB-TolC in vivo, a continuación desarrollamos un ensayo de inhibición del flujo de salida covalente utilizando células vivas de E. coli. Para este propósito, construimos el acrAB transmitido por plásmido con variantes de acrA que contienen sustituciones Cys únicas en los conectores flexibles entre el MP y el barril αβ (Leu50Cys, Ile52Cys, Arg225 Cys, Glu229Cys, Asn232Cys) y entre el barril αβ y los dominios lipoilo (Arg183Cys, Thr205Cys, Asp284Cys) (Figura 5c). Las células que producen las variantes WT y AcrA (Cys) B se trataron con una sonda reactiva a Cys MTS-rodamina 6G (MTS-R6G). Esta sonda es un sustrato de AcrAB-TolC y se espera que su unión covalente a los residuos Cys de AcrA ubicados en posiciones importantes para la flexibilidad conformacional y/o la función de la proteína inhiba la actividad de eflujo de la bomba AcrAB-TolC. En este ensayo, utilizamos células de E. coli Δ9-Pore hiperporinadas que carecen de los nueve transportadores dependientes de TolC y que portan las variantes AcrA (Cys) AcrB transmitidas por plásmidos43. La hiperporinación del OM eliminó la barrera de permeabilidad del OM y facilitó la penetración de MTS en el periplasma para alcanzar AcrA (Cys). Las células se trataron previamente con MTS, la sonda que no había reaccionado se lavó y se analizó la cinética de salida de un sustrato fluorescente Hoechst 33342 (Hoechst).

Un proceso experimental de ensayo de inhibición del eflujo covalente. MTS-R6G es la sonda reactiva Cys y Hoechst 33342 es el sustrato de eflujo fluorescente. b Las células Δ9-Pore de E. coli que producen el complejo AcrAB-TolC que portan las variantes de AcrA indicadas se dividieron en dos alícuotas y una de las alícuotas se trató con una sonda MTS reactiva a Cys. Después de una incubación durante 15 minutos a 37 °C, las células se lavaron y se analizó la acumulación intracelular de Hoechst como se describió anteriormente61. Los datos cinéticos se ajustaron a una función de caída exponencial única en ráfaga y las tasas iniciales calculadas de acumulación de Hoechst (μM/s) se representan en función de la concentración añadida externamente de Hoechst61. Los gráficos son la media y las barras de error indican la desviación estándar (n = 3) de mediciones independientes. Datos de origen proporcionados como archivo de datos de origen. c Estructura AcrA (PDB 5O66) con residuos mutados resaltados23. Los residuos azules no tienen ningún efecto sobre el eflujo y los residuos anaranjados sí lo tienen.

Encontramos que el pretratamiento con MTS-R6G de células que producen AcrAB-TolC de tipo salvaje o que portan un vector vacío no afectó la acumulación de Hoechst, lo que sugiere que los dos residuos Cys intrínsecos de AcrB ubicados en el dominio transmembrana de la proteína no afectan la resultado del ensayo (Fig. 5b). A continuación, comparamos los niveles de acumulación de Hoechst en las células que producen diferentes variantes de AcrA (Cys) y con y sin pretratamiento con MTS-R6G. Todas las bombas ensambladas con variantes de AcrA (Cys) fueron tan eficientes en el flujo de salida de Hoechst como la bomba de tipo salvaje, lo que es consistente con su capacidad para proteger las células Δ9-Pore de la novobiocina, eritromicina y SDS (Tabla complementaria 3). La excepción es AcrA (Leu50Cys), que parecía ser completamente funcional en la medición de MIC (Tabla complementaria 3), pero solo fue parcialmente eficiente en la salida de Hoechst (Fig. 5b).

El pretratamiento con MTS-R6G inhibió la actividad de las variantes AcrA Leu50Cys, Thr205Cys y Asn232Cys únicamente, mientras que no se observó una inhibición significativa para otras variantes de AcrA (Cys) analizadas (Fig. 5b y Fig. 15 complementaria). Por lo tanto, solo estos residuos Cys de AcrA son vulnerables a la unión e inhibición de MTS-R6G, mientras que otros residuos Cys son inaccesibles en el complejo AcrAB-TolC o la unión de MTS en estos sitios no afecta la función del complejo. Ninguno de estos residuos está implicado en los sitios de unión AcrA:AcrB caracterizados, por lo que el efecto inhibidor sobre el eflujo no se debe a interacciones perturbadas en el ensamblaje de AcrAB-TolC44. Una posibilidad para este efecto inhibidor es que la unión de MTS provoque la reducción de la flexibilidad conformacional de AcrA, pero aquí no se pueden sacar conclusiones definitivas sobre la dinámica restringida. Sin embargo, los resultados muestran que estos tres sitios dentro de las bisagras flexibles entre los dominios AcrA son críticos para el flujo de salida de la bomba AcrAB-TolC.

T205 está en el sitio IV, el sitio de unión propuesto de NSC 60339, y evidencia adicional que esta área es un sitio farmacológico para la inhibición de AcrA. Curiosamente, otros dos residuos mutaron en el sitio IV, pero no tuvieron ningún efecto sobre el flujo de salida (R183 y D284). Estos residuos residen en la periferia del sitio IV (Fig. 5b) y probablemente sean menos críticos para la función de AcrA que T205, que se encuentra en el centro de la hendidura. Además, T205 mostró una protección significativa en presencia de NSC 60339 en ambas construcciones de AcrA, destacando su importancia para la flexibilidad de AcrA. Los otros dos residuos que tuvieron un efecto inhibidor sobre el eflujo se encuentran lejos del sitio IV, en el conector flexible entre los dominios MP-barril αβ. N232C y L50C están ubicados en la parte inferior de esta región y orientados en la misma dirección (Fig. 5c). Los otros residuos que no tuvieron efecto sobre el eflujo se colocaron encima de N232 y L50 y se orientaron en la dirección opuesta. Curiosamente, ambas posiciones también se encontraron en péptidos significativamente protegidos en presencia de NSC 60339 en nuestros experimentos HDX-MS. Este hallazgo sugiere que NSC 60339 está estabilizando esta área aguas abajo de su sitio de unión. Por lo tanto, esto proporciona otro sitio farmacológico en AcrA para el diseño futuro de EPI.

En resumen, nuestros hallazgos respaldan que NSC 60339 se posiciona en la hendidura entre los dominios de barril lipoilo y αβ (sitio IV) y causa una restricción de largo alcance en la dinámica de la columna vertebral de AcrA en sus cuatro dominios. Este comportamiento se observó tanto en construcciones de monómero como de pseudodímero. Proponemos que NSC 60339 actúa como una cuña molecular dentro de esta hendidura, restringiendo significativamente la dinámica estructural de AcrA, lo que podría tener implicaciones para las transiciones conformacionales requeridas durante la rotación funcional de la bomba AcrAB-TolC (Fig. 6). Un estudio reciente de la bomba de eflujo AcrAB-TolC ensamblada in situ confirma que uno de los protómeros AcrA en el dímero AcrA está anclado a la membrana interna e interactúa con AcrB, mientras que también se estira para interactuar con la capa de peptidoglicano y TolC45. Se sugiere que la región N-terminal del segundo protómero interactúe con el subdominio AcrB PC2, que sufre extensos cambios conformacionales a lo largo del mecanismo de rotación23. Esta arquitectura podría permitir que AcrA comunique cambios conformacionales en AcrB a TolC, a medida que recorre el mecanismo de rotación, lo que da como resultado que TolC pase al estado "abierto". Por lo tanto, la inhibición de NSC 60339 puede provocar que AcrA pierda su capacidad para adaptarse a los cambios en el periplasma y comunicar los cambios conformacionales de AcrB a TolC, necesarios para el flujo de salida. Esto podría afectar la bomba de varias maneras; (1) La interacción de AcrA con AcrB y TolC puede verse interrumpida a medida que AcrA se vuelve más rígida, (2) Es posible que AcrA no pueda mantener un canal sellado durante la rotación funcional y 3) Es posible que TolC no se "abra" con tanta eficiencia.

En condiciones normales, a medida que AcrB recorre sus tres estados de su mecanismo de rotación (L Suelto, T Apretado, O Abierto), la información de transición conformacional se transmite a través de AcrA a TolC, asegurando que esté en el estado "abierto" para el flujo de salida. AcrA se restringe conformacionalmente una vez que NSC 60339 se "cuña" entre sus dominios lipoilo y barril αβ, lo que reduce su capacidad para transmitir los movimientos conformacionales de AcrB y, posteriormente, inhibe la rotación funcional y el flujo de salida. Esquema basado en la estructura in situ reportada en Chen et al.45.

Trabajos recientes han identificado a AcrA como una necroseñal15,16. Las células muertas liberan AcrA, que se une a TolC en la membrana externa de las células vivas para enviar una señal, aumentando la salida de fármacos y la expresión de otras bombas. Se ha demostrado que NSC 60339 puede inhibir tanto el eflujo como la necroseñalización en AcrA16. Además, si bien la novobiocina no inhibe el eflujo, ya que su objetivo principal en las bacterias es la ADN girasa, también puede inhibir la necroseñalización, aunque no en el mismo grado que NSC 6033946. Se propone que AcrA interactúe con TolC a través de su contacto de horquilla α-helicoidal. el poro TolC. Mostramos que una estabilización global de AcrA por NSC 60339 puede explicar su capacidad de inhibición de la señalización necroseñal, posiblemente al reducir su capacidad para unirse a TolC en el exterior de las células. Sin embargo, también se ha demostrado que la novobiocina inhibe la necroseñalización en AcrA, y no observamos un efecto significativo de su unión en la dinámica estructural de AcrA. Por lo tanto, la novobiocina puede inhibir la necroseñalización de una manera diferente, o la dinámica estructural puede sólo formar parte de la capacidad de necroseñalización de AcrA. La función de necroseñal de AcrA se ha descubierto recientemente y, por lo tanto, se requieren más investigaciones sobre los mecanismos de necroseñalización para comprender esta capacidad y cuál es la mejor manera de inhibirla para combatir la generación de resistencia bacteriana a múltiples fármacos a través de este proceso.

En general, en este trabajo proponemos un mecanismo de acción para el inhibidor de AcrA NSC 60339. Esto proporciona un modelo para atacar la bomba de eflujo de múltiples fármacos AcrAB-TolC, proporcionando una plataforma para comprender y desarrollar la próxima generación de EPI. Se ha observado que AcrA exhibe intercambiabilidad con otros PAP en sistemas no afines, destacando su flexibilidad47. Por lo tanto, descubrir la dinámica estructural de AcrA es esencial para comprender su papel como PAP flexible dentro de una serie de complejos de eflujo de múltiples fármacos ensamblados. De manera más general, mostramos cómo se puede usar HDX-MS en combinación con simulaciones de MD, información estructural de alta resolución y ensayos de microbiología para comprender esta dinámica y determinar los mecanismos moleculares de inhibición, como se vio anteriormente con AcrB48.

AcrAS que carece de los residuos del péptido señal 1 a 24 y del sitio de lipidación Cys25 se clonó en un plásmido pET28a con un conector 6xHis y LE (todos los cebadores utilizados para la clonación se pueden encontrar en la Tabla complementaria 4) 17,27. AcrAS se purifica a partir de la fracción citoplasmática como se informó anteriormente17. Brevemente, se transformó pET28a que contenía AcrAS en células ΔacrAB de E. coli C43(DE3). Se añadieron 7 ml de un cultivo de Luria-Bertani (LB) durante la noche a 1 litro de cultivo de LB precalentado (x6) que contenía 30 µg/ml de kanamicina y se cultivaron a 37 °C hasta que se alcanzó una DO600 de 0,6. El cultivo se indujo con IPTG 1 mM y se cultivó durante 3 h a 37 °C. Las células se recogieron mediante centrifugación a 4200 x g durante 30 minutos y se lavaron con solución salina tampón fosfato (PBS) enfriada con hielo.

Los sedimentos celulares se congelaron a -20 °C y luego se descongelaron y resuspendieron en Tampón A (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, imidazol 5 mM, pH 7,4) y se complementaron con un inhibidor de proteasa (Roche), PMSF 100 mM, 2 μl de benzonasa, β-ME 5 mM y lisozima. La suspensión celular se lisó mediante sonicación a una amplitud de 40, 6 × 15 s con descansos de 90 s. El material insoluble se eliminó mediante centrifugación a 20.000 xg durante 30 minutos a 4 °C. Las membranas se sedimentaron a 200.000 x g durante 1 h a 4 ° C.

El sobrenadante que contenía la fracción citosólica se recogió y se filtró a través de un filtro de 0,22 μm (Thermo Fisher Scientific). La muestra se cargó en una columna HiTrap de 1 ml (GE Healthcare) equilibrada en tampón B (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, glicerol al 10 %, pH 7,4). La columna se lavó con 20 volúmenes de columna (CV) de tampón B, 10 CV de tampón B con imidazol 50 mM y eluyó con tampón B que contenía imidazol 500 mM. AcrAS se cargó directamente en una columna de cromatografía de exclusión molecular (SEC) HiLoad 16/600 Superdex de 200 pg (GE Healthcare) equilibrada en tampón C (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, glicerol al 10 %, pH 7,4). Se utilizó un caudal de 1 ml min-1 para las columnas HiTrap y SEC. Las fracciones máximas de AcrAS se combinaron y se congelaron instantáneamente a -80 °C. Se utilizó SDS-PAGE y nMS para evaluar la pureza y la concentración se determinó mediante Nanodrop.

AcrAL que contenía AcrA de longitud completa se amplificó a partir de ADN genómico de E. coli y se clonó en un plásmido pET28a utilizando las enzimas de restricción NcoI y XhoI, con un conector LE y 6xHis. La expresión, el crecimiento y la lisis celular fueron los mismos que con AcrAS.

Las membranas se sedimentaron a 200.000 x g durante 1 h a 4 ° C. Los sedimentos de membrana se resuspendieron a 40 mg/ml en tampón A enfriado con hielo suplementado con PMSF 100 mM y una tableta de inhibidor de proteasa y se homogeneizaron con un mortero de teflón Potter-Elvehjem y un tubo de vidrio. AcrAL se solubilizó a partir de membranas homogeneizadas con detergente de n-dodecil-β-D-maltósido (DDM) al 1% (p/v) (Anatrace) a 4 °C. El material insoluble se eliminó mediante centrifugación a 100.000 xg durante 30 minutos a 4 °C. Las etapas HiTrap y SEC son las mismas que las anteriores, excepto que todos los buffers contenían 0,03% (p/v) de DDM.

AcrASD que contenía una molécula de AcrAS con una mutación Cys25Ala, un conector TRRIT y una segunda molécula de AcrAS que carecía de los residuos 1 a 25 y que contenía un conector LE y 6xHis se clonó en un plásmido pET21d+ utilizando las enzimas de restricción NcoI y XhoI. Para facilitar la detección de posibles positivos, se diseñó un sitio BamHI en la región del conector. La expresión, el crecimiento y la purificación celular fueron idénticos a AcrAS excepto que se usaron 100 μg/ml de ampicilina en el crecimiento celular.

AcrB se expresó y purificó como se informó anteriormente48. Brevemente, el plásmido pET15b que contenía AcrB se transformó en células E.coli C43(DE3) ΔacrAB. Se añadieron 7 ml de un cultivo de LB durante la noche a 1 litro de cultivo de LB precalentado (x6) que contenía 100 µg/ml de ampicilina y se cultivaron a 37 °C hasta que se alcanzó una DO600 de 0,6-0,8. El cultivo se indujo con IPTG 1 mM y se cultivó durante 16 a 18 h a 18 °C. Las células se recogieron mediante centrifugación a 4200 x g durante 30 minutos y se lavaron con PBS enfriado con hielo.

El sedimento celular se resuspendió en tampón A (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) y se complementó con un inhibidor de proteasa (Roche), PMSF 100 μM, 2 μl de benzonasa y β-ME 5 mM. La suspensión celular se pasó dos veces a través de un procesador microfluidizador (Microfluidics) a 25.000 psi y 4 °C. El material insoluble se eliminó mediante centrifugación a 20.000 xg durante 30 minutos a 4 °C. Las membranas se sedimentaron a 200.000 × g durante 1 h a 4 ° C (Thermo Fisher Scientific). Los sedimentos de membrana se resuspendieron a 40 mg/ml en tampón A enfriado con hielo suplementado con PMSF 100 µM y una tableta de inhibidor de proteasa y se homogeneizaron con un mortero de teflón Potter-Elvehjem y un tubo de vidrio.

AcrB se extrajo de las membranas homogeneizadas con copolímero SMA 2000 al 2,5% (p/v) durante 2 h a temperatura ambiente para formar nanodiscos nativos. El material insoluble se eliminó mediante centrifugación a 100.000 xg durante 30 minutos a 4 °C. La muestra se incubó con 1 ml de resina de afinidad de agarosa NTA súper níquel (Generon) equilibrada en tampón B (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, glicerol al 10 %, pH 7,4) durante la noche a 4 °C con agitación suave. La muestra se transfirió a una columna de flujo por gravedad y se lavó con 20 CV de tampón B, 10 CV de tampón B con imidazol 50 mM y eluyó con tampón B que contenía imidazol 500 mM. Luego se intercambió el tampón AcrB por tampón C (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, glicerol al 10 %, pH 7,4) utilizando una columna de desalinización PD-10 (GE Healthcare) y se congeló instantáneamente a -80 °C. Se utilizó SDS-PAGE para evaluar la purificación y la concentración se determinó mediante Nanodrop.

AcrAS, AcrASD, AcrAL purificados se intercambiaron en una solución volátil (acetato de amonio 100 mM, pH 6,0/7,4) +/- 0,03 % de DDM utilizando un dispositivo de intercambio centrífugo (Micro Bio-Spin 6, Bio-Rad) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. , o mediante una columna de aumento SEC Superdex 10/200 a un caudal de 0,4 ml/min. Los experimentos de espectrometría de masas nativa se realizaron en un espectrómetro de masas Synapt G2-Si (Waters) o The Q-Exactive Plus UHMR (Thermo Fisher Scientific).

Cada muestra se cargó en capilares caseros de vidrio de borosilicato recubiertos de oro y se montó en un espectrómetro de masas Synapt G2-Si (Waters), donde se realizaron experimentos de espectrometría de masas nativa. Se realizó una ionización por nanoelectropulverización (nESI) y los iones de proteínas generados se extrajeron al vacío del espectrómetro de masas. Los siguientes parámetros del instrumento se optimizaron cuidadosamente para evitar la activación de iones y el desarrollo de proteínas: voltaje capilar: 1,4 kV, cono de muestreo: 30 V, polarización de CC de la trampa: 15 V, energía de colisión de la trampa: 2 V y energía de colisión de transferencia: 2 V. Presiones se establecieron en 5,91 × 10−2 mbar en la región de origen (respaldo) y en 1,58 × 10−2 mbar en las celdas de colisión de trampa y transferencia (gas de colisión: He).

Para AcrAL, se requirió una mayor energía para liberar la proteína de su entorno hidrofóbico. Por lo tanto, el cono de muestreo se ajustó a 120 V y la energía de colisión de la trampa a 50-200 V. Los demás parámetros del instrumento se mantuvieron igual.

Solo se midieron AcrAS/SD utilizando el Q-Exactive Plus UHMR (Thermo Fisher Scientific). Con muestras que contenían novobiocina, se añadió el fármaco a la proteína y se dejó incubar durante 30 minutos antes del análisis de EM. Las configuraciones de UHMR utilizadas fueron: voltaje de pulverización de 1,5 kV, temperatura capilar de 60 °C, IST apagado, atrapamiento extendido de 60.

Los datos se procesaron y analizaron utilizando MassLynx v.4.1 (Waters) y UniDec (v.4.2.2)49.

NSC 60339 y novobiocina se adquirieron de MedChemExpress y Caymen Chemical, respectivamente. Se prepararon soluciones madre de NSC 60339 (10 mM) y novobiocina (600 μM) en DMSO al 100% y se sonicaron durante 2 a 3 h para garantizar la solubilidad. Obtener un porcentaje máximo de complejo proteína:fármaco durante el marcaje con deuterio es una consideración importante para los experimentos HDX-MS. NSC 60339 y novobiocina se unen a AcrAS con afinidad μM (NSC 60339 con una KD de 78 μM y novobiocina con una KD de 4,3 μM, medida mediante mediciones previas de SPR a pH 6,0)10. Para asegurarnos de tener el máximo complejo proteína:fármaco presente en nuestras condiciones de etiquetado, utilizamos la siguiente ecuación50:

La proteína se incubó con NSC 60339 500 μM o 30 μM de novobiocina antes de diluirla en un tampón de marcado que contenía la misma concentración de fármaco. Se mantuvo constante un 5% de DMSO durante toda la experimentación para garantizar la solubilidad del fármaco.

Los experimentos HDX-MS se realizaron en un sistema de espectrómetro de masas Xevo G2-XS QTof de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) nanoAcquity (Waters). La identificación de péptidos optimizada y la cobertura de péptidos para AcrAS/SD se realizaron a partir de controles no deuterados. El flujo de trabajo de muestra óptimo para HDX-MS de AcrAS/SD fue el siguiente: se diluyeron 5 µl de AcrAS/SD (20 µM) en 95 µl de cualquiera de los tampones de equilibrio (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, DMSO al 5 %, + /-NSC 60339/Novobiocina, pH 6,0) o tampón de etiquetado (tampón de equilibrio deuterado) a 20 °C. Después de tiempos fijos de marcaje con deuterio, las muestras se mezclaron con 100 µl de tampón de extinción (ácido fórmico, GuHCl 1,6 M, fosfcolina al 0,1 %, pH 1,9) para proporcionar una muestra apagada a pH 2,4. Luego se cargaron 70 µl de muestra apagada en un bucle de muestra de 50 µl antes de inyectarlas en una columna de digestión de pepsina Enzymate™ en línea (Waters) en ácido fórmico al 0,1 % en agua (caudal de 200 µl/min) a 20 °C. Los fragmentos pépticos se atraparon en una precolumna Acquity BEH c18 VANGUARD 1,7 μM (Waters) durante 3 minutos. Luego, los fragmentos pépticos se eluyeron utilizando un gradiente de 8 a 35 % de ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo (caudal de 40 μl/min) en una columna Acquity UPLC BEH C18 1,7 μM 1,0 × 100 mm enfriada (Waters). Tanto la trampa como la UPLC se mantuvieron a 0 °C. Los péptidos eluidos se ionizaron mediante electropulverización en el espectrómetro de masas Xevo G2-XS QTof. Los datos de MSE se adquirieron con una rampa de energía de colisión de trampa de 20 a 30 V para la adquisición de alta energía de iones de producto. Se utilizó argón como gas de colisión de la trampa a un caudal de 2 ml/min. Se utilizó leucina encefalina para corregir la precisión de la masa de bloqueo y el espectrómetro de masas se calibró con yoduro de sodio. La columna de digestión de pepsina Enzymate™ en línea (Waters) se lavó tres veces con lavado de pepsina (1,5 Gu-HCl, 4 % de MeOH, 0,8 % de ácido fórmico, 0,1 % de fos-colina) y se realizó un análisis en blanco entre cada muestra con pepsina. lavar sin fos-colina, para evitar un arrastre significativo de péptidos entre ejecuciones.

Todos los puntos de tiempo y controles de deuterio se realizaron por triplicado/cuadruplicado. La identificación de secuencia se realizó a partir de datos de MSE de muestras no deuteradas digeridas de AcrAS/SD utilizando el software ProteinLynx Global Server 3.0.2 (Waters). Luego, los péptidos de salida se filtraron usando DynamX (v. 3.0) usando estos parámetros: intensidad mínima de 1481, longitud de secuencia peptídica mínima y máxima de 5 y 20 respectivamente, productos MS/MS mínimos de 1, productos mínimos por aminoácido de 0,11, y un umbral máximo de error MH+ de 5 ppm51. Todos los espectros se examinaron visualmente y sólo se utilizaron para el análisis aquellos con una relación señal-ruido adecuada. La cantidad de absorción relativa de deuterio para cada péptido se determinó usando DynamX (v. 3.0) y no se corrigió por intercambio inverso, ya que solo se usaron diferencias relativas para el análisis y la interpretación y no hubo ningún beneficio al normalizar los datos52. La única excepción es el mapa de calor HDX de AcrAS, al que se aplicó la corrección de intercambio inverso (Figura complementaria 3). La absorción fraccional relativa (RFU) se calculó a partir de la siguiente ecuación, donde Y es la absorción de deuterio para el péptido a en el tiempo de incubación t, y D es el porcentaje de deuterio en la solución de marcado final:

Se decidió un nivel de significancia límite para cada conjunto de datos en función de la calidad de los datos definida previamente53,54. Los intervalos de confianza para las mediciones diferenciales de HDX de cualquier punto temporal individual se determinaron según una prueba T de Welch bilateral utilizando el software HDeXplosion55. Sólo se consideraron significativos los péptidos que cumplían el correspondiente límite de ΔHDX y un intervalo de confianza del 99%. Todas las figuras de la estructura ΔHDX se generaron a partir de los datos utilizando HDeXplosion y Chimera55,56. Todos los datos y metadatos de respaldo se informan en el archivo de datos de origen (Figuras complementarias 3, 7, 9, 10 y 14).

Se diluyeron 5 µl de proteína (+/−5% DMSO) en 95 µl de tampón de marcado (+/−5% DMSO) marcado a pH 6,0 durante 251 min a 50 °C. Esto sigue el protocolo de marcaje previamente determinado durante 10 min a pH 7,4 a ~5 °C por debajo de la Tm de la proteína57. Esto es para asegurar la máxima incorporación de deuterio de la proteína desplegada. El contenido de deuterio en la mezcla de reacción es idéntico al correspondiente experimento HDX. Después de 251 minutos, las proteínas se dejaron a temperatura ambiente durante 2 minutos, luego en hielo durante 2 minutos antes de congelarlas instantáneamente y almacenarlas a -80 °C hasta el análisis por LC-MS.

Se utilizaron geles Novex Tris-Glycine (4-20%) para los geles SMA-PAGE nativos (Thermo Fisher Scientific). Todos los geles nativos se procesaron utilizando tampón de procesamiento Tris-Glicina (Tris 25 mM, pH 8,8, glicina 192 mM). El colorante de carga nativo fue el tampón de muestra nativo Novex Tris-Glycine (Thermo Fisher Scientific). Los geles SMA-PAGE se ejecutaron a 150 V durante 90 a 120 minutos a 4 °C. Para detectar proteínas, los geles se tiñeron con Quick Coomassie Stain (NeoBiotech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las proteínas AcrAS y AcrASD se inmovilizaron utilizando el método de acoplamiento de aminas. Para este propósito, las superficies del chip CM5 (BiaCore) se activaron con N-hidroxisuccinimida 0,05 M y N-etil-N-(3-dietilaminopropil)carbodiimida 0,2 M. AcrAS y AcrASD se inyectaron sobre superficies inmediatamente después de la activación. Después de la inmovilización, el exceso de grupos reactivos se bloqueó inyectando etanolamina HCl 0,5 M (pH 8,0). La inmovilización y los experimentos de unión posteriores se realizaron en un tampón que contenía HEPES-KOH 20 mM (pH 7,0), NaCl 150 mM y DDM al 0,03% suplementado con DMSO al 5%. El chip CM5 contiene cuatro cámaras, mientras que la primera (superficie de control) se activó y procesó de la misma manera, pero se omitió la proteína durante el paso de inmovilización. La segunda y tercera cámaras contenían AcrAS y AcrASD (ligando) inmovilizados. Las densidades inmovilizadas de ambas proteínas (ligando) fueron 4743 y 4054 unidades de respuesta (RU), respectivamente. Los sensogramas se recogieron y analizaron como se describió anteriormente58,59.

Todas las sustituciones de aminoácidos en acrA se introdujeron mediante el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange II XL utilizando p151acrABHis como plantilla60. El diseño del cebador y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para cada sustitución se realizaron siguiendo el protocolo del fabricante.

La cepa Δ9-Pore de E. coli (acrB ΔacrD ΔacrEF::spc ΔemrB ΔemrY ΔentS::cam ΔmacB ΔmdtC ΔmdtF attTn7::mini-Tn7T Tpr araC ParaBAD fhuAΔC/Δ4L) se construyó previamente43. Esta cepa se utilizó en estudios de susceptibilidad a antibióticos e inhibición covalente.

Las susceptibilidades de las células Δ9-Pore de E. coli que contienen variantes AcrA(Cys)AcrB transmitidas por plásmidos contra SDS, novobiocina, eritromicina y vancomicina se determinaron mediante microdilución en caldo al doble. Brevemente, se subcultivaron cultivos de una noche en caldo LB (triptona, 10 g/l; extracto de levadura, 5 g/l; NaCl, 5 g/l), y las células se cultivaron a 37 °C en un agitador a 225 rpm hasta La DO600 alcanza entre 0,2 y 0,3. Para la expresión adecuada del poro, se añadió L-arabinosa (concentración final de 0,1%) a cada cultivo y las células se siguieron cultivando hasta que la DO600 alcanzó 1,0. La concentración mínima inhibidora de cada cepa bacteriana frente a diferentes antibióticos se midió en placas de 96 pocillos. Se agregaron células en crecimiento exponencial a cada pocillo y se incubaron durante 18 h. Las placas se escanearon para determinar la OD600 final mediante el lector de microplacas Spark 10M (TECAN).

Cultivo nocturno de células ∆9-Pore de E. coli que transportan p151-AcrABHis. Se subcultivaron plásmidos con las sustituciones indicadas en AcrA con arabinosa al 0,1% durante 6 h para lograr una DO600 de 1,0. Para la inhibición covalente de AcrA, las células se dividieron en dos alícuotas y una alícuota se incubó con MTS 20 μM durante 15 minutos a 37 °C. La alícuota de células de comparación se incubó con un disolvente blanco (dimetilsulfóxido) en las mismas condiciones. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con tampón HMG (tampón HEPES-KOH 50 mM, pH 7,0, sulfato de magnesio 1 mM y glucosa 0,4 mM) y se resuspendieron en tampón HMG hasta una DO600 de ~1,0, a temperatura ambiente. Se probaron diferentes concentraciones de Hoechst para medir la eficiencia de eflujo del sustrato de cada célula mutante midiendo la cinética de acumulación de Hoechst en λex = 350 nm y λem = 450 nm. Los datos se normalizaron y los parámetros cinéticos se calcularon como se describió anteriormente utilizando un programa MATLAB61. Brevemente, los cursos temporales de la absorción de Hoechst (Figura 13 complementaria) se ajustaron a la función de caída exponencial única de ráfaga F = A1 + A2 ∙ (1−exp(−kt)), donde A1 y A2 describen la magnitud de la absorción rápida y pasos lentos, respectivamente, y k es la velocidad del paso lento. Los pasos rápidos y lentos se atribuyeron a la unión de Hoechst a los lípidos (es decir, en el periplasma) y al ADN cromosómico (es decir, en el citoplasma), respectivamente. Las tasas iniciales de acumulación de Hoechst en el citoplasma se calcularon como VI = A2 ∙ k y se representaron en la Fig. 5b y en la Fig. 15 complementaria.

Todos los espectros de CD se midieron en un espectrofotómetro de dicroísmo circular Aviv, modelo 410. Se usó una concentración final de proteína de 0,4/0,26 mg/ml en una celda desmontable Suprasil rectangular de cuarzo de 1,0 mm de paso óptico. Cada muestra se escaneó dos veces de 260 a 190 nm a intervalos de 1 nm, con un tiempo promedio de 0,5 s, a temperaturas que oscilaron entre 25 y 90 °C, con incrementos de 5 °C. El DMSO se mantuvo al 0,5%. Espectros analizados en SigmaPlot.

Las simulaciones MD del monómero unido a NSC 60339 se inicializaron utilizando la estructura acoplada de Darzynkiewicz et al.14, mientras que las de apo utilizaron la misma estructura sin el compuesto eliminado. Cada uno de los dos sistemas se solvató en una caja cúbica de agua de ~(170-Å)3 para permitir el movimiento de la proteína sin utilizar restricciones de orientación y se ionizó con NaCl 150 mM, lo que dio como resultado un tamaño de sistema de ~476.000 átomos (suplementario). Figura 16). El sistema de dímero se construyó a partir de la estructura del dímero AcrA en PDB 2F1M18. El dominio MP se añadió en función de la estructura del monómero, y los residuos en los dominios lipoilo y barril αβ se ajustaron para que coincidieran con sus posiciones en la estructura unida a NSC 60339, después de lo cual el compuesto se modeló en ambas copias de AcrA. Los sistemas apo y unidos se solvataron en una caja cúbica de agua de ~(210-Å)3 y se ionizaron con NaCl 150 mM, lo que dio como resultado un tamaño de sistema de ~906.000 átomos.

Cada sistema se equilibró durante 0,5 ns con todos los átomos de proteína y ligando restringidos, seguido de 4,5 ns con solo la cadena principal de proteína y los átomos de ligando restringidos. Luego, cada sistema se equilibró durante 100 ns por triplicado. Las simulaciones se ejecutaron utilizando NAMD2.1462 o NAMD363 según el recurso computacional utilizado y el campo de fuerza CHARMM36m64. Los parámetros del campo de fuerza para NSC-60339 se generaron utilizando el servidor web CGenFF65 y se proporcionan como Datos complementarios 2. Se utilizó un paso de tiempo de 2 fs, con interacciones no enlazadas de corto alcance (corte de 12 Å con una función de conmutación que comienza a 10 Å) actualizado en cada paso de tiempo y la electrostática de largo alcance actualizada cada dos pasos de tiempo utilizando el método de Ewald de malla de partículas66. Se mantuvo una temperatura constante de 310 K mediante dinámica de Langevin, mientras que se mantuvo una presión constante de 1 atm utilizando un pistón de Langevin. Todos los resultados presentados se promediaron en tres réplicas.

Toda la preparación y análisis del sistema se llevaron a cabo utilizando VMD. RMSF y SASA se midieron utilizando las funciones 'medir rmsf' y 'medir sasa' de VMD. En el caso de RMSF, las fluctuaciones se miden utilizando como referencia la posición promedio sobre los cuadros muestreados. Se realizó un seguimiento de la desviación cuadrática media (RMSD) para dominios individuales y se representa en la Figura complementaria 17 para AcrAS y en la Figura complementaria 18 para AcrASD.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de HDX-MS generados en este estudio se proporcionaron en el archivo de datos de origen, y las tablas de resumen y los gráficos de absorción de HDX-MS se proporcionaron como datos complementarios 1 y 3. Además, los datos proteómicos de espectrometría de masas se depositaron en el ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD041359. Las simulaciones de MD generadas en este estudio se proporcionaron como Datos complementarios 2. Se puede acceder a las estructuras de proteínas de otras publicaciones a las que se hace referencia en este artículo con los códigos de acceso de PDB 5O66 y 2F1M. La estructura AlphaFold2 se generó a partir de la entrada UniProt P0AE06. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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El trabajo en King's College London fue apoyado por una beca UKRI Future Leaders Fellowship (MR/S015426/1) para ER y una beca de doctorado del King's College London para BRL. Este trabajo también fue apoyado por la subvención R01-AI052293 de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. para HIZ, JMP y los recursos computacionales de JCG se proporcionaron a través de XSEDE (TG-MCB130173), que cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias de EE. UU. (NSF; ACI-1548562). Esta investigación utilizó recursos del Entorno de Computación y Datos para la Ciencia (CADES) en ORNL, administrado por UT Battelle, LLC, para el DOE bajo el contrato DE-AC05–00OR22725. Este trabajo también utilizó el clúster Hive, que cuenta con el respaldo de NSF (1828187) y está administrado por la Asociación para un entorno informático avanzado (PACE) en GT. El Q-Exactive Plus UHMR de la Universidad de Leeds utilizado para la EM nativa fue financiado por The Wellcome Trust (208385/Z/17/Z). AJH fue financiado por una subvención BBSRC IPA (BB/R018561/1/) en colaboración con GSK y UCB Pharma. Los autores agradecen a Valeria Calvaresi por sus consejos sobre el análisis y las estadísticas de HDX.

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BRL, JCG, HIZ y ER diseñaron el proyecto; BRL, LMNS, DH y ER realizaron todos los experimentos y análisis de espectrometría de masas, excepto las mediciones UHMR que fueron realizadas por AH y FS; BRL, MM, ER y HIZ clonaron, purificaron y caracterizaron todas las construcciones de proteínas. MRU y HIZ realizaron ensayos y análisis de susceptibilidad y eflujo bacteriano; KMK, JMP y JCG llevaron a cabo experimentos de dinámica y acoplamiento molecular y análisis de dinámica posmolecular; FS, JMP, DH, JCG, HIZ y ER supervisaron o apoyaron financieramente el proyecto; BRL, JCG, HIZ y ER escribieron el manuscrito con aportaciones de los demás autores.

Correspondencia a James C. Gumbart, Helen I. Zgurskaya o Eamonn Reading.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Jani Bolla, Beibei Wang y al otro revisor anónimo por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Russell Lewis, B., Uddin, MR, Moniruzzaman, M. et al. La restricción conformacional da forma a la inhibición de una proteína adaptadora de eflujo de múltiples fármacos. Nat Comuna 14, 3900 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39615-x

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Recibido: 20 de diciembre de 2022

Aceptado: 15 de junio de 2023

Publicado: 18 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39615-x

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